Tłumaczenie ważnego artykułu z Nature.
Abstrakt
Dotychczasowe doniesienia sugerowały, że terpeny znalezione w Cannabis sativa mogą wywoływać efekt entourage (efekt otoczenia), poprzez który terpeny modulują działanie kannabinoidów prowadząc do wzmocnienia ich efektów działania. Jednak hipoteza ta wywołuje kontrowersje, a dowody nie są pewne. W związku z tym zbadaliśmy działanie terpenów Cannabis sativa oraz ich działanie w połączeniu z kannabinoidowym agonistą WIN55,212 stosując metody in vitro oraz in vivo. Odkryliśmy że terpeny alfa-hunulen, geraniol (kup geraniol), Linalol (kup linalol) oraz beta-pinen (kup beta-pinen) wywołują typowe zachowania tetrady kannabinoidowej, sugerują więc aktywność kannabimimetyczną. Niektóre zachowania mogą być blokowane przez kannabinoidy lub antagonistów receptora adenozynowego, co sugeruje mieszany mechanizm działania. Opisane efekt behawioralne były potęgowane przy dodaniu WIN55,212, co sugeruje że terpeny mogą zwiększać działanie kannabinoidów. Eksperymenty in vitro wykazały że wszystkie terpeny aktywowały receptor CB1R, a niektóre z nich aktywowały też inne receptory. Znaleziska sugerują, że terpeny Cannabis są kannabimimetycznymi ligandami o wielu funkcjach. Stanowią argument za hipotezą efektu entourage i mogą zostać wykorzystane w celu wzmocnienia terapeutycznych właściwości kannabinoidów.
Wstęp
Cannabis sativa jest dwupienną rośliną, należy do rośliny Cannabaceaei, wraz z inną popularną rośliną Humulus lupulus (chmiel)[1]. Roślina sama w sobie jest „biofarmaceutykiem”, zawierającym setki fitochemikaliów[2], wiele z nich z leczniczymi zastosowaniami. Wśród nich fitokannabinoidy i terpeny były najbardziej badane w związku z ich leczniczymi i terapeutycznymi zastosowaniami[3,4]. Terpeny, które stanowią podstawowe składniki olejków eterycznych z wielu roślin, były używane od tysięcy lat w celach terapeutycznych. Nadają również smak oraz aromat konopii i innym roślinom. Badania na zwierzętach i ludziach wykazały, że terpeny wykazują działanie przeciwbólowe, antybakteryjne, przeciwzapalne i inne terapeutyczne efekty[5,6,7]. Fito-kannabinoidy, przede wszystkim Δ9-tetrahydrokannabinol (THC), stanowiły główny obiekt badań[4]. Chociaż konopie indyjskie zawierają oba rodzaje fitozwiązków, terpeny były mniej badanie niż fitokannabinoidy, zaś potencjalne interakcje między terpenami a fitokannabinoidami, gdy roślina jest używana w celach rekreacyjnych lub leczniczych, nie były właściwie wcale badane.
Hipotetyczne interakcje między różnymi fitokannabinoidami i terpenami, które mogą wywoływać efekt odmienny od efektu po zastosowaniu wyłącznie jednego z tych związków, znany jest jako „efekt entourage” (efekt otoczenia)[3,5,8]. Dowody na efekt Entourage składają się z argumentów rozumowania dedukcyjnego[5,9], pewnych sugestii klinicznych[10,11], i kilku badań przedklinicznych[8,12,13,14]. W literaturze można odnaleźć także sceptycyzm[15] oraz pewne dowody zaprzeczające interakcjom kannabinoidów i terpenów, obecne w badaniach przedklinicznych[7,16]. Pozostaje niejasne czy terpeny mogą wpływać na aktywność kannabinoidów, a jeśli wpływają, to czy wpływ ten jest efektem bezpośredniego wpływu na receptory kannabinoidowe, tak jak w przypadku β-kariofilenu[13], czy pośredniej modulacji poprzez inne mechanizmy.
Jeśli zostanie wykazane, że terpeny modulują aktywność kannabinoidów, mogłoby stanowić potężne narzędzie doskonalące terapię kannabinoidami. Główne fitokannabinoidy THC i kannabidiol (CBD) działają poprzez mechanizmy kannabinoidowe oraz niekannabinoidowe[4,17] wywołując korzyści terapeutyczne, przede wszystkim w terapii chronicznego bólu[18,19]. Jednak efektywność wydaje się być skromna, zaś THC wywołuje uciążliwe efekty psychoaktywne i somatyczne efekty uboczne[19,20,21]. Jeśli związki terpenowe mogą modulować fitokanabinnoidy takie jak THC, możemy zidentyfikować terpeny które zwiększą terapeutyczną efektywność kannabinoidów, jednocześnie niwelując niechciane efekty uboczne. Terapię taką można prowadzić wykorzystując konkretny chemotyp rośliny lub połączenie oczyszczonych terpenów i kannabinoidów.
W tym badaniu chcieliśmy opisać działanie różnych terpenów in vivo oraz in vitro, zarówno stosowanych samodzielnie, jak i w połączeniu z agonistą kannabinoidowym. Nasze wyniki wykazały bezpośrednie interakcje między kannabinoidami i terpenami. Wykazano że wybrane terpeny wywierają polifarmakologiczny wpływ na receptory kannabinidowe oraz niekannabinoidowe, oraz selektywnie modulują aktywności agonistów kannabinoidowych.
Wyniki
Terpeny wywołują zachowania tetrody kannabinoidowej u myszy
Pierwsza seria eksperymentów miała wykazać czy wybrane terpeny/terpenoidy (α-Humulen, β-Pinen, Linalool [terpenoid], Geraniol [terpenoid], i β-Kariofilen jako domniemana kontrola agonisty receptora kannabinoidowego typu 2 [CB2]) wywołują efekty tetrody kannabinoidowej poprzez receptor CB1: antynocycepcja (blokowanie bólu), hipolokomocja (obniżenie mobilności), katalepsja, hipotermia[20]. Terpeny te zostały wybrane na podstawie ich zawartości w Cannabis sativa: α-Humulen, β-Pinen, Linalool, i β-Kariofilen występują w większym stężeniu, zaś Geraniol w stężeniu niższym lub nieoznaczonym. Chociaż nie jest jasne, w jakim stężeniu występuje Geraniol, wybraliśmy ten ligand w związku z jego opisanym działaniem anty-nocyceptywnym [22]. Terpeny zostały podane w kilku dawkach (50-200 mg/kg) i.p., następnie wykonano test drgnięcia ogona (tail flick assay) u samców oraz samic CD-1 myszy. Ponieważ β-Kariofilen został opisany jako selektywny agonista CB2, i wywołuje efekty związane z CB2 przy dawkach 50 mg/kg[13], zastosowaliśmy dawkę 100mg/kg jako znanego agonisty CB2 dla naszych oznaczeń. Ponieważ jest agonistą selektywnym, nie powinien powodować efektów charakterystycznych wyłącznie dla tetrady związanej z CB1.
Efekty testu były zróżnicowane (Fig. S1A-E). Geraniol i α-Humulen wykazały średnią efektywność na poziomie 40-50% w zależności od podanej dawki (Fig. S1A,D), podczas gdy β-Pinen wykazał niską efektywność niezależną od dawki (Fig. S1B), sugerując działanie częściowego agonisty w najwyższym zakresie dawki. Linalool wykazał niską efektywność zależną od dawki (Fig. S1C), podobnie jak β-Kariofilen w zastosowanej dawce (Fig. S1E). Pozytywna kontrola WIN55,212-2 wykazała wzrost latencji termicznej zależny od dawki, z efektywnością większą niż badane substancje, osiągając niemal progowe wartości już dla dawki 10mg/kg (Fig. S1F).
Następnie badano terpeny w pozostałych zachowaniach tetrody w czasie szczytowego działania. Okienko szczytowego działania zostało wyznaczone w teście drgania ogona (np. 0-30 minut po iniekcji). α-Humulen, β-Pinen, Geraniol i Linalool, tak jak kontrola WIN55,212-2, wywołały znaczną hipotermię (Fig. S2A), znaczny wzrost katalepsji (Fig. S2B), i znaczny spadek aktywności lokomotorycznej (Fig. S2C,D) w porównaniu ze swoimi wyjściowymi wartościami. Kontrola CB-2 selektywna, β-Kariofilen, zarówno jak kontrola rozpuszczalnikowa nie wykazywały hipotermii ani katalepsji. Obserwacje hipolokomocji mogły zostać zaburzone poprzez przyzwyczajenie myszy do pojemników z otwartą przestrzenią pomiędzy pomiarami wyjściowymi oraz poiniekcyjnemi, jak wykazano w przypadku kontroli rozpuszczalnika (Fig. S2C,D). W związku z tym eksperyment został powtórzony bez badania wartości wyjściowej. W tym eksperymencie WIN55,212-2, β-Pinen, Geraniol i Linalool wykazały spadek przebytego dystansu oraz czasu mobilności, podczas gdy kontrola rozpuszczalnikowa, β-Kariofilen i α-Humulen nie wykazały znaczącego spadku (Fig. S3A,B). Jednakże, wyniki dla α-Humulen zbliżyły się do wartości znaczącej (p=0.057). Wszystkie wyniki sugerują, że badane terpeny są kannabimimetyczne, każdy wywołuje co najmniej 3 z 4 klasycznych zachowań tetrody kannabinoidowej, podczas gdy kontrola rozpuszczalnikowa oraz β-Kariofilen nie wywoływały tych zachowań. Wykres radarowy obrazujący wpływ różnych terpenów na zachowania tetrady znajduje się na Fig. 1.
Terpeny wywołują kannabimimetyczne zachowania tetrady u myszy.
Analiza danych z Fig. S1-S3 zaprezentowana w postaci wykresu radarowego. Zmiana procentowa od stanu wyjściowego została obliczona dla każdego terpenu dla każdego objawu tetrody; został uwzględniony efekt szczytowy dla testu ogona (Fig. S1), podczas gdy pozostałe objawy miały pojedynczy pomiar. Zmiana procentowa została następnie znormalizowana względem dawki 5.6 mg/kg WIN55,212-2 (1.0 na wykresie). Wykres dowodzi, że wszystkie terpeny wywołują wszystkie 4 objawy tetrody, natomiast ich efektywność różni się; ich działanie może być silniejsze lub słabsze od kontroli pozytywnej WIN55,212-2.
Antynocycepcja związana z testem ogona zachodzi poprzez CB1 i działanie terpenów jest addytywne z działaniem kantabinoidu
Aby zbadać rolę receptora CB1 w możliwym pośredniczeniu w efektach tetrody wywoływanymi przez terpeny, zastosowaliśmy CB1-selektywnego antagonistę rimonabant. Najpierw wykazaliśmy, że rimonabant może całkowicie lub częściowo odwrócić efekty tetrody wywołane przez pozytywną kontrolę kannabinoidową WIN55,212-2 (Fig. S4). Następnie zastosowaliśmy ten związek w teście ogona na antynocycepcję dla terpenów i okazało się, że wcześniejsze zastosowanie rimonabantu całkowicie blokuje efekty terpenów w tym teście, sugerując że terpeny wywołują antynocycepcję w teście ogona poprzez CB1 (Fig. 2).
Terpeny wywołują CB-1-zależną i addytywną względem kannabinoidów antynocycepcję w teście drgania ogona. Myszom podano 200 mg/kg terpenu, dodatkowo w połączeniu z 5.6 mg/kg WIN55,212-2 lub po podaniu 10 mg-kg rimonabantu, podanie i.p. Następnie myszy poddawano testowi drgania ogona przez 2h. (A) α-Humulen, (B) β-Pinen, (C) Linalool, (D) Geraniol. Dane przedstawiają średnią ±SEM latencji drgania ogona (n=10-14 na grupę). Statystyka analizowana poprzez RM ANOVA dwukierunkowa, Dunett post hoc; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Porównano z samodzielnym efektem terpenów w tym samym czasie. Odpowiedź zwierząt na 5.6 mg/kg WIN55,212-2 („WIN Alone”) z Fig. S1 jest uwzględniona na każdym wykresie dla porównania.
W celu przetestowania potencjalnych interakcji terpenów i kannabinoidów, terpeny zostały połączone z WIN55,212-2 w teście drgania ogona. Kiedy dany terpen został połączony z niższą dawką WIN55,212-2, łączny efekt wzrósł w porównaniu z pojedynczymi dawkami terpenu lub WIN55,212-2 (Fig. 2), ukazując interakcje terpen/kannabinoid w modulowaniu antynocycepcji. Wymaga dalszego zbadania natura tych interakcji: czy jest to interakcja addytywna czy synergistyczna.
Jednakże, jako odwrotny agonista rimonabant może odwrocić odpowiedzi w teście ogona, poprzez wpływ odwrotnego agonizmn na poziomie systemowym na antynocycepcję. Innymi słowy rimonabant może spowodować blokadę antynocycepcji poprzez działanie pro-nocyceptywne. Aby to wykluczyć, zbadaliśmy efekt uprzedniego podania rimonabantu na: antynocycepcję wywołaną przez morfinę w teście drgnięcia ogona (Fig. S5A,B), z zastosowaniem dawki o takiej samej wydajności w porównaniu z naszymi terpenami; oraz na bazowe testy latencji termicznej w zmniejszonej temperaturze łaźni wodnej (Fig. S5C). Rimonabant nie wykazał znaczącego wpływu na antynocycepcję indukowaną przez morfinę, ani na bazowe testy latencji termiczne, co oznacza że terpeny wywołują swoje działanie antynocyceptywne poprzez mechanizm zależny od CB1.
Hipotermia wywoływana przez terpeny jest addytywna z kannabinoidową hipotermią ale zazwyczaj nie zachodzi przez CB1
Następnie chcieliśmy określić mechanizmy hipotermii indukowanej przez terpeny. Kiedy podaliśmy jednocześnie terpen oraz WIN55,212-2, hipotermia wzrosła w porównaniu z efektami po podaniu jedynie terpenu lub jedynie WIN55,212-2 (Fig. 3). Wyniki są podobne do otrzymanych w anty-nocycepcji drgnięcia ogona, i stanowi kolejny argument za interakcją terpen/kannabinoid.
Terpeny wywołują hipotermię głównie poprzez mechanizmy inne niż CB1/A2a i są addytywne z efektami kannabinoidów. Zmierzono temperaturę myszy, następnie podano 200 mg/kg terpenu pojedynczo, lub w połączeniu z 5.6 mg/kg WIN55,212-2, lub po uprzednim podaniu 10 mg/kg rimonabantu, lub 10 mg/kg istradefyllenu. Po 30 minutach temperatura została zmierzona ponownie. (A) α-Humulen, (B) β-Pinen, (C) Linalool, (D) Geraniol. Dane ukazują średnią temperaturę ±SEM (n=10-20 na grupę). Statystyki analizowane poprzez RM ANOVA dwukierunkowa, Turkey post hoc; ****p < 0.0001 w porównaniu z wartością wyjściową; xx p < 0.01, xxx p < 0.001, xxxx p < 0.0001 w porównaniu z wartością po podaniu terpenu. Przerywana linia oznacza hipotermię dla 5.6 mg/kg WIN55,212-2, z Fig. S2A.
Jednakże, inaczej niż w przypadku drgnięcia ogona, rimonabant był w stanie tylko częściowo odwrócić hipotermię indukowaną przezα-Humulen (Fig. 3A) i nie wywierał wpływu na inne terpeny (Fig. 3B-D). Rimonabant tylko częściowo odwrócił hipotermię indukowaną przez WIN55,212-2 (Fig. S4C), co nadal sugeruje że CB1 może pośredniczyć tylko w hipotermii indukowanej przez α-Humulen, nie pełni tej roli w przypadku innych terpenów. To dalej sugeruje że chociaż terpeny są kannabimimetyczne, mogą one wywoływać te efekty poprzez mechanizmy zależne oraz niezależne od CB1.
Chcąc zbadać udział innych receptorów, zbadaliśmy rolę receptorów adenozynowych A2a (A2a) w hipotermii indukowanej przez terpeny. Aktywacja A2a może wywołać hipotermię, hipolokomocję i stany podobne do katalepsji[23] i wiele badań badało interakcje między systemem kannabinoidowym i adenozynowym[24,25,26,27,28]. Znany terpen z konopii indyjskich, D-Limonen, jest agonistą receptora A2a[29]. Założyliśmy więc, że aktywacja receptorów A2a może mieć udział w efektach indukowanych przez badane terpeny, które są niewrażliwe na rimonabant. Jednakże, uprzednie podanie antagonisty A2a istradefyllenu częściowo odwróciło hipotermię wywołaną przez α-Humulen (Fig. 3A), nie wywołując żadnego efektu w przypadku pozostałych terpenów (Fig. 3B-D), co sugeruje że A2a tak jak CB1 w zasadzie nie bierze udziału w hipotermii indukowanej przez terpeny. Analiza jest tym bardziej skomplikowana, ponieważ okazało się że sam istradefyllen wywołuje niewielki ale znaczący efekt hipotermii i hiperlokomocji, w związku z czym wyniki muszą być ostrożnie interpretowane (Fig. S6).
Katalepsja terpenowa jest częściowa addytywna z kannabinoidową i głównie zachodzi poprzez A2a
Kontynuowaliśmy nasze analizy dla katalepsji indukowanej przez terpeny. W przeciwieństwie do poprzednich wyników, połączenie terpenu z WIN55,212-2 dawało efekt addytywny dla α-humulenu i β-pinenu (Fig. 4A-B), ale nie dla Linaloolu i Geraniolu (Fig. 4C,D). Zaczynamy dostrzegać zróżnicowanie w interakcjach terpen/kannabinoid, co sugeruje że różne terpeny mogą być stosowane w celu modulowania różnych efektów działania kannabinoidów. Odkryliśmy także, że rimonabant nie ma wpływu na katalepsję wywoływaną przez Geraniol i β-pinen, zaś powoduje niewielką lecz znaczącą redukcję efektu α-humulenu i Linaloolu, sugerując że ten efekt terpenów jest głównie CB-1-niezależny (Fig. S4).
Katelepsja indukowana przez terpeny zachodzi częściowo przez CB1, zachodzi silne przez A2a, i jest częściowo addytywna z kannabinoidową katalepsją. Najpierw wyznaczono wartość wyjściową w teście pierścienia w ciągu 5 minut, następnie myszom podano 200 mg/kg terpenu pojedynczo, w połączeniu z 5.6 mg/kg WN55,212-2, lub po uprzednim podaniu 10 mg/kg rimonabantu lub 10 mg/kg istradefyllenu. Po 15 minutach, myszy znowu zostały poddane testowi pierścienia na 5 minut. (A) α-Humulen, (B) β-Pinen, (C) Linalool, (D) Geraniol. Dane ukazują średnią ±SEM % katalepsji (n=10-20 na grupę). Statystyki analizowane poprzez RM ANOVA dwukierunkowa, Turkey post hoc; **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, nieznaczące (ns) w porównaniu z wartością wyjściową; x p < 0.05, xx p < 0.01, xxx p < 0.001, xxxx p < 0.0001 w porównaniu z wartością po przyjęciu terpenu. Przerywana linia reprezentuje odpowiedź kataleptyczną po podaniu 5.6 mg/kg WIN55,212-2, z Fig. S2B.
Odkryliśmy znaczący udział A2a w tej odpowiedzi. Podanie istradefyllenu całkowicie blokowało efekt kataleptyczny dla α-Humulenu i β-Pinenu, sugerując że A2a jest koniecznym elementem w katalepsji wywoływanej przez te terpeny (Fig. 4A,B). Istradefyllen częściowo blokował również katalepsję wywoływaną przez Linalool i Geraniol, co znaczy że jest on również istotną częścią machanizmu katalepsji dla tych terpenów (Fig. 4C,D). Nasze wyniki sugerują, że A2a pełni główną rolę w katalepsji indukowanej przez terpeny, zaś CB1 bierze niewielki udział lub nie bierze go wcale w katalepsji indukowanej przez terpeny.
Hipolokomocja indukowana przez terpeny jest częściowo addytywna z kannabinoidową i częściowo zachodzi poprzez A2a
Nasza analiza czasu mobilności jako pomiaru hipolokomocji jest ukazana na Fig. 5. Obserwowaliśmy dalszy spadek mobilności, jeśli terpen został połączony z W WIN55,21202 dla α-Humulenu, β-Pinenu i Linaloolu (Fig. 5A-C), ale nie dla Geraniolu (Fig. 5D). Jest to kolejny argument za addytywnymi interakcjami terpeny/kannabinoidy, jednak wpływ jest różny dla różnych terpenów. Rimonabant nie wywierał wpływu na wartości czasów mobilności dla żadnego z terpenów, co sugeruje że działanie terpenów jest niezależne od CB1. Jednakże zaobserwowaliśmy znaczące odwrócenie działania β-Pinenu w przypadku zastosowania istradefyllenu (Fig. 5B) i Geraniolu (Fig. 5D), co oznacza że efekty działania tych terpenów zachodzą poprzez A2a. Wykonaliśmy także pomiary hipolokomocji przez pomiar przebytego dystansu w Fig. S7; dane te były mniej solidne niż pomiar mobilności, ale także w przypadku tych pomiarów zaobserwowaliśmy odwrócenie efektów przez istradefyllen dla β-Pinenu (Fig. S7B) i Geraniolu (Fig. S7D), co potwierdza nasze wyniki z Fig. 5.
Hipolokomocja indukowana przez terpeny zachodzi częściowo poprzez A2a i jest ona addytywna z kannabinoidami. Myszom podano 200 mg/kg terpenu pojedynczo, w połączeniu z 5.6 mg/kg WIN55,212-2, lub po uprzednim podaniu 10 mg/kg rimonabantu lub 10m mg/kg istradefyllenu, i.p. Po 10 minutach myszy zostały umieszczone ponownie w pudełku z otwartą przestrzenią na 5-minutowy test. (A) α-Humulen, (B) β-Pinen, (C) Linalool, (D) Geraniol. Dane prezentują średnią wartość czasu mobilności ± SEM w sekundach (n=10-20 na grupę). Statystyki analizowano metodą jednokierunkową ANOVA, Dunnett post hoc; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 w porównaniu z wynikami dla terpenu bez dodatków. Czarna kropkowana linia oznacza poziom mobilności dla kontroli rozpuszczalnika, czerwona kropkowana linia oznacza efekt 5.6 mg/kg WIN55,212-2; obydwa wyniki za Fig. S3A.
Nasze mechanistyczne badania sugerują że badane terpeny zwiększają ogólnie, lecz selektywnie, efekty kannabinoidu WIN55,212-2, co oznacza potencjalną możliwość modulowania efektów kannabinoidów przez terpeny. Nasze odkrycia także sugerują mieszane CB-1-zależne, A2a-zależne i niezależne odeń mechanizmy efektów wywieranych przez terpeny. Nasze odkrycia sugerują, że terpeny Cannabis mogą wywoływać znaczące efekty farmakologiczne i mogą zostać wykorzystane do selektywnego modulowania wpływu terapii Cannabis/kannabinoidowej.
Linalool wykazuje różnice zależne od płci
We wszystkich powyższych eksperymentach wykorzystano zarówno samice, jak i samce myszy, i w niemal każdym przypadku nie zaobserwowano żadnych różnic. Jednakże zaobserwowaliśmy specyficzne różnice dla płci w przypadku Linaloolu. Podczas testu drgnięcia ogonem zarówno samce, jak i samice, wykazywały taką samą odpowiedź na Linalool podany pojedynczo, i efekty były tak samo blokowane przez rimonabant dla obydwóch płci. Jednak zaobserwowano różnice zależne od płci, kiedy Linalool został połączony z WIN55,212-2; samce wykazywały większe addytywne efekty po połączeniu dwóch związków, które były widoczne szybciej, podczas gdy samice wykazywały opóźnienie w odpowiedzi i brak wzmocnienia w porównaniu z samym Linaloolem (Fig. S8A). W przypadku testów hipolokomocji, ponownie zaobserwowaliśmy różnice dla Linaloolu; dla samców rimonabant powodował odwrócenie efektu, zaś u samic istradefyllen powodował odwrócenie efektu, co sugeruje że efekt zachodzi poprzez CB1 u samców i poprzez A2a u samic (Fig. S8B-C). Te obserwacje sugerują, że występują różnice w działaniu terpenów zależne od płci, chociaż mechanizm który się za tym kryje jest nieznany.
Terpeny aktywują CB1 in vitro
Nasze wyniki behawioralne sugerują że terpeny mogą interagować z receptorami CB1, i prawdopodobnie z innymi. Chcieliśmy zatem sprawdzić, czy wybrane terpeny zachowują się jak agoniści receptora CB1 in vitro, najpierw oznaczając CB-1 zależną aktywację ERK. Każdy z testowanych terpenów, włączając przypuszczalnego agonistę CB2 β-Kariofilen, aktywował kaskadę ERK w komórkach CB1-CHO (Fig. 6, S9). Aktywacja ta była wrażliwa na rimonabant (Fig. 7A, S10A,B), co sugeruje że terpeny zachowują się jak agoniści CB1 in vitro, co jest zgodne z naszymi wynikami badań in vivo.
Podanie terpenów aktywuje CB1 in vitro. Komórki CB1-CHO były pozbawione surowicy przez 1h, a następnie podano różne stężenia (A) α-Humulenu, (B) β-Pinenu, (C) Linaloolu, (D) Geraniolu, (E) β-Kariofilenu, przez 5 minut. Uwzględniono także kontrolę z rozpuszalnikiem oraz kontrolę pozytywną 10 uM WIN55,212. Lizaty zostały następnie poddane analizie Western blot w celu oznaczenia fosfo-ERK i całkowitego ERK (sprawdź Metody). Wykresy reprezentują ilościowo wyniki (pERK/tERK). Dane przedstawiono jako % stymulacji WIN55,212-2 (n=3 niezależne eksperymenty). Statystyki analizowano jednokierunkową metodą ANOVA, Dunnett post hoc; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 w porównaniu ze stymulacją przez rozpuszczalnik (kontrola rozpuszczalnika).
Terpeny indukują CB-1-zależnie i CB-1-niezależne kaskady in vitro. (A) CB1-CHO komórki były pozbawione surowicy na 1h, następnie zastosowano 10 uM rimonabantu lub rozpuszczalnik przez 5 minut. Następnie zastosowano 500 uM terpenu, 10uM WIN55,212-2, lub sam rozpuszczalnik, przez 5 minut. Lizaty zostały następnie poddane analizie Western blot w celu oznaczenia fosfo-ERK i całkowitego ERK (sprawdź Metody). Wykresy reprezentują stopień fosforylacji ERK indukowanej przez kombinacje terpenów i rimonabantu (pERK/tERK). Dane wyrażono jako % stymulacji WIN55,212-2 (n=3 niezależne eksperymenty). (B) Komórki WT CHO zostały pozbawione surowicy na 1 h, a następnie podano 500 uM terpenu, 10 uM WIN55,212-2 lub rozpuszczalnik przez 5 minut, następnie analizowano jak powyżej. (C) Komórki WT CHO zostały pozbawione surowicy na 1 h, a następnie podano 10 uM rimonabantu lub rozpuszczalnika, następnie podano 500 uM terpenu, 10 uM WIN55,212-2 lub rozpuszczalnika, na 5 minut, następnie analizowano jak powyżej. Dane analizowano metodą jednokierunkową ANOVA, Dunnett post hoc; **p < 0.01, ****p < 0.0001, w porównaniu ze stymulacją przez rozpuszczalnik.
Znaleźliśmy dowody, że niektóre terpeny działają na inne receptory lub efektory w celu aktywowania ERK in vitro gdy przebadaliśmy terpeny w komórkach WT-CHO, w których podobno nie występują receptory CB (Fig. 7B, S10C). Linalool, Geraniol i WIN55,212-2 nie wywoływały fosforylacji ERK w komórkach WT CHO, jednak α-Humulen, β-Pinen i β-Kariofilen aktywowały ERK w sposób niezależny od rimonabantu (Fig. 7C, S10D-E). Ponieważ rimonabant może działać jako odwrotny agonista, co może przyczyniać się do opisanych wyników, testowaliśmy kilka stężeń rimonabantu wobec aktywacji ERK indukowanej przez płodową surowicę bydlęcą (FBS) (Fig. S11). Rimonabant nie zredukował znacząco fosforylacji ERK powodowanej przez FBS. Te wyniki sugerują, że każdy z badanych terpenów indukuje fosforylację ERK, która jest zależna od receptora CB1, podczas gdy niektóre wpływały także na inne receptory w komórkach.
Warto zauważyć, że każdy z badanych terpenów powodował także fosforylację ERK w komórkach z ekspresją CB2 (Fig. S12), co oznacza że mogą interagować także z CB2, co zostało już opisane dla β-Kariofilenu[13]. Te odkrycia stanowią kolejne dowody terpenowej poli-farmakologii, która może wywołać zmiany na poziomie behawioralnym oraz komórkowym na drodze mechanizmów CB1-zależnych oraz CB1-niezaleznych (np. Adenozynowych A2a lub CB2).
Jednakże, te wyniki można wyjaśnić także niespecyficznymi lub niereceptorowymi interakcjami terpenów. W związku z tym zbadaliśmy zdolność terpenów do aktywowania receptora opioidowego mu, z rodziny GPCR. β-pinen, α-humulen, β-kariofilen i morfina (kontrola pozytywna), wszystkie spowodowały stymulację ERK w komórkach MOR-CHO, podczas gdy Geraniol i Linalool nie wywołały takiej odpowiedzi (Fig. S13A). Te same terpeny wywoływały tę stymulację także w komórkach WT-CHO, co opisano wcześniej (Fig. 7), co sugeruje że stymulacja nie może zachodzić poprzez receptor opioidowy. Rzeczywiście, antagonista Nalokson zablokował stymulację wywoływaną przez morfinę, ale nie miał żadnego wpływu na stymulację wywoływaną przez terpeny (Fig. S13B). Kiedy porównamy te wyniki do wcześniejszych badań na CB1-CHO i WT-CHO, eksperyment ten sugeruje, że terpeny nie mogą aktywować receptora opioidowego mu, co stanowi argument za tym, że ich interakcja z CB1/2 jest specyficzna i zachodzi poprzez receptor.
Następnie dokonaliśmy bardziej wyczerpującej analizy farmakologicznych właściwości każdego z terpenów wobec CB1. Najpierw wykonaliśmy testy wiązania konkurencyjnego w preparatach membranowych CB1-CHO, aby określić czy czy każdy z nich konkurowałby z CP55,940 o ortosteryczne miejsce wiązania (Fig. 8A). Jak wykazano, WIN55,212-2 indukował typową krzywą odpowiedzi na stężenie, w pełni konkurując z CP55,940 przy wyższych stężeniach. Z badanych terpenów, Geraniol był jedynym który wykazywał pełną konkurencję. α- Humulen i β-Kariofilen wykazywały pewną konkurencję i semi-dwufazowe właściwości. Linalool i β-Pinen wykazywały niewielką lub zerową konkurencję. Te wyniki oznaczają zarówno ortosteraczne jak i potencjalnie allosteryczne mechanizmy wiązania do CB1 dla niektórych terpenów.
Analiza wiązania oraz funkcjonalna terpenów wobec CB1. Podano wartości dopasowanej krzywej jako średnią z 95% przedziału ufności. (A) Błony CB1-CHO zostały poddane testom wiązania konkurencyjnego z udziałem terpenów i WIN55,212-2 wobec 3H-CP55,940. Dane przedstawiają średnie ± SEM wiązanie specyficzne (n=5 niezależnych eksperymentów). Wartości IC50: WIN55,212-2 = 90.4 nM (36–206); Geraniol = 44.2 μM (11.1–193) Inne terpeny nie wykazały krzywych konkurencyjnych, które mogły zostać dopasowane. (B) Do komórek CB1-CHO podano różne stężenia terpenów lub WIN55,212-2 na 30 minut. Następnie zmierzono zdolność do inhibicji akumulacji cAMP stymulowanego przez forskolinę (sprawdź Metody). Dane przedstawiają średnią ± SEM dla % cAMP stymulowanego forskoliną (n=4 niezależnych eksperymentów). Wartości IC50: WIN55,212-2 = 591 nM (289–1,180). Dla terpenów nie wyznaczono pełnej krzywej inhibicji. (C) Komórkom CB1-CHO-DX podano różne stężenia związków, rekrutacja βarrestin2 została oznaczona 1,5h później (sprawdź Metody). Dane przedstawiają średnią ± SEM maksymalnej rekrutacji WIN55,212-2 (n=3 niezależne eksperymenty). EC50: WIN55,212-2 = 1,600 nM (1,110–2,310). (D) Komórki CB1-CHO-DX zostały przemyte 500 uM terpenu przez 5 minut, następnie różnymi stężeniami WIN55,212-2 przez 1,5h (sprawdź Metody). Dane przedstawiają średnią ± SEM maksymalnej rekrutacji WIN55,212-2 (n=3 niezależne eksperymenty). Wartości EC50: WIN55,212-2 sam = 254 nM (194–331); WIN + Geraniol = 3,080 nM (2180–4350); WIN + α-Humulen = 471 nM (295–743); WIN + Linalool = 679 nM (480–956); WIN + β-Pinen = 302 nM (147–621); WIN + β-Kariofilen = 283 nM (169–470).
Po aktywacji receptora CB1, dwie kolejne kaskady sygnalizacyjne mogą zostać zainicjowane: inhibicja Cyklady adenylylowej oraz rekrutacja β-arrestyny2. Najpierw zbadaliśmy, czy terpeny mogą zahamować cyklozę adenylylową w komórkach CB1-CHO. Każdy z badanych terpenów powododowat częściową inhibicję cAMP stymulowanej przez forskolinę, ale tylko w wysokich mikromolarnych stężeniach, podczas gdy WIN55,212-2 wykazał wyższą efektywność (Fig. 8B). Ten efekt wywoływać przez WIN55,212-2 i terpeny był częściowo odwracany przez rimonabant, poza β-Pinenem (Fig. S15A). Rimonabant stosowany samodzielnie nie wywierał wpływu na formowanie cAMP stymulowanej przez forskolinę, co sugeruje brak odwrotnego agonizmu (Fig. S14B). Te wyniki sugerują, że terpeny indukują działanie kaskad sygnalizacyjnych poprzez CB1.
Kiedy wykonaliśmy test rekrutacji βarrestin2, terpeny nie wykazały agonizmu w żadnym badanym stężeniu, podczas gdy pozytywna kontrola WIN55,212-2 wykazała agoniam (Fig. 8C). Następnie ustaliliśmy czy terpeny mogą zapobiegać lub promować rekrutację arrestyny w sposób allosteryczny i zbadaliśmy każdy terpen w połączeniu z WIN55,212-2 (Fig. 8D). Tylko Geraniol wykazał możliwość potencjalnej allosterycznej interakcji – możliwe że jest negatywnym allosterycznym modulatorem (NAM) lub stronniczym częściowym odwrotnym agonistą w stosunku do WIN55,212-2, co opisano poniżej. Kiedy przebadano cały zakres stężeń Geraniolu w połączeniu z WIN55,212-2, wykazał redukcję w rekrutacji zależną od dawki (Fig. S14C).
Dyskusja
Zgodnie z wprowadzeniem, terpeny były już badane ze względu na ich terapeutyczne właściwości. W wielu badaniach zidentyfikowano ich właściwości przeciwzapalne, przeciwbólowe, antybakteryjne oraz inne korzystne cechy[3,4]. Jednakże niewiele badań miało na celu zidentyfikować cele molekularne i mechanizmy stojące za działaniami tych związków. Podobnie, podczas gdy istniały hipotezy, że terpeny i kannabinoidy mogą współdziałać, wywołując „efekt entourage”, niektóre badania przeprowadzone do tej pory wykazały brak takich interakcji[16,30]. Nasze badanie jest w związku z tym pierwszym, które pokazuje, że terpeny i kannabinoidy mogą wywoływać addytywny efekt, gdy zostaną połączone. Jest także pierwszym badaniem, w którym zidentyfikowano receptory CB1 oraz A2a jako cele terpenów, oraz w którym opisano role tych receptorów. W wywoływaniu kannabimimetycznych efektów in vivo.
Pojawia się więc pytanie: dlaczego nasze badania wykazały istnienie interakcji terpeny/kannabinoidy, podczas gdy dwa inne badania ich nie wykazały. Jest kilka potencjalnych wyjaśnień. W jednym z badań wykorzystano linię komórkową AtT20 transferowana ludzkimi receptorami CB1 lub CB2, w której oddziaływanie wiązało się ze zmianą potencjału membrany[16]. To badanie nie obserwowało wpływu terpenów na CB1/2, podczas gdy nasze tak; jednakże, opisywane badanie zostało przeprowadzone na wysoce specyficznej linii komórkowej z pojedynczym możliwym efektem oddziaływania: zmianą potencjału membrany. Jest więc całkiem możliwe, że terpeny nie wywołują zmiany potencjału membrany za pośrednictwem CB1/2, tak jak i my zaobserwowaliśmy zmiany ERK i cAMP, lecz nie w rekrutacji arrestryny (Fig. 8). Drugie badanie zastosowało podobne podejście in vitro, nie wykazując wiązania do receptora ani sygnalizacji cAMP dla badanych terpenów[30]. Jednakże, w tym badaniu zastosowano mieszaninę terpenów, w której stężenie żadnego z terpenów nie przekraczało 50%; zastosowano również maksymalne stężenie 10 uM, podczas gdy my zaobserwowaliśmy aktywację receptora w wyższych stężeniach. Te różnice tłumaczą odmienne wyniki. Ponadto my zastosowaliśmy model in vivo, który pozwolił zaobserwować szerszy zakres potencjalnych oddziaływań, w porównaniu z modelem in vitro, który bada tylko bardzo specyficzne wyniki.
Warto też zauważyć, że zastosowaliśmy wysokie stężenia terpenów w celu zaobserwowania aktywacji. Jest to szczególnie widoczne w naszych badaniach in vitro, w których zastosowanie ponad 10 uM, lub aż do 500 uM zależnie od terpenu, było konieczne, aby zaobserwować aktywację. Chociaż wysokie stężenia były wymagane in vitro, aktywacja była w pełni CB1-zależna, ponieważ mogła zostać całkowicie odwrócona przez podanie rimonabantu (Fig. 7A). Jednakże, dawki konieczne in vivo nie była aż tak ekstremalne, wywołując pełną odpowiedź w większości testów dla większości terpenów przy 200 mg/kg. Jest to zbieżne z hipotezą, że multifunkcjonalne związki o niskiej sile działania mogą mieć pewną przewagę nad środkami działającymi selektywnie, poprzez wywoływanie istotnego efektu systemowego poprzez wiele efektorów molekularnych[31,32,33,34]. Biorąc to pod uwagę, związki takie jak nasze terpeny, które wywołują niewielki wpływ na wiele receptorów, mogą wywołać istotny efekt systemowy (w zależności od docelowych receptorów). Zgadza się to z naszymi wynikami z in vitro, które ukazują oddziaływanie o niskiej wydajności, oraz z naszymi wynikami z in vivo, które wykazują istotne efekty behawioralny w porównaniu z pełnym agonistą CB1. Chociaż jest to jasne, że wybrane terpeny mogą interagować z receptorem CB1 i wywoływać sygnalizację, dalsze badania są konieczne w celu opisania mechanizmu tych działań, oraz zbadania wszystkich celów oddziaływania dla terpenów. Środki o niskiej mocy działania są też niekoniecznie mniej pożądane w terapii. Istnieją leki o niskiej mocy, które są stosowane w farmakoterapii, np. Ibuprofen (dawkowanie 600-2400 mg/dzień), proglumid (dawkowanie do 2400 mg/dzień), metformin (maksymalna dawka 2550 mg/dzień) (dawkowanie na podstawie UpToDate).
Nasze obserwacje wykazały ważną rolę CB1 w, między innymi, pośredniczeniu w efektach badanych terpenów, zarówno in vitro jak i in vivo. Chociaż wydaje się, że są agonistami CB1 o niskiej sile, istnieją alternatywne hipotezy dla mechanizmu działania, na podstawie otrzymanych wyników. Dwie alternatywy dla bezpośredniego agonizmn CB1 to: (1) bezpośrednia modulacja dynamiki membrany, przesunięcie równowagi aktywacji CB1 w kierunku aktywowanego receptora; (2) modulacja przez terpen syntezy endokannabinoidów i/lub degradacja, która mogłaby potem prowadzić do aktywacji CB1 przez te endokannabinoidy. Wcześniej zasugerowano, że skład membrany i jej dynamika oddziałują istotnie receptor kannabinoidowy[35]. Rzeczywiście, zostało to również opisane w przypadku innych receptorów[36], a skład membrany zmienia równowagę aktywacji. Terpeny są wysoce liofilowe z natury, i w związku z tym prawdopodobne jest, że bezpośrednio oddziałują ze środowiskiem membrany, potencjalnie także z mikrodomenami membrany, takimi jak tratwy lipidowe. Jeśli te interakcje prowadzą do termodynamicznie faworyzowanego „aktywnego” receptora CB1, właściwości odwrotnego agonisty rimonabantu mogłyby nadal blokować sygnalizację. W związku z tym, zostało opisane że komórki CHO mogą brać udział w autokrynowej i parakrynowej sygnalizacji poprzez syntezę endokannabinoidów[37,38], w tym przypadku 2-arachodonyloglicerolu (2-AG). W naszych testach z wykorzystaniem komórek CHO, istnieje możliwość, że terpeny modulują syntezę lub degradację 2-AG w celu stymulowania sygnalizacji CB1, który mógłby być blokowany przez rimonabant. Te alternatywne hipotezy są dalej wspierane przez ogólnie słabe wiązanie konkurencyjne terpenów do CB1 (Fig. 8A). Jest to aktualnie badane w naszym laboratorium. Jednakże, te alternatywne mechanizmy muszą nadal posiadać pewną selektywność, ponieważ terpeny nie były w stanie aktywować receptora opioidowego mu, GαI-sprzężonego receptora GCPR, podobnego do CB1/2 (Fig. S13). Mimo to niespecyficzne mechanizmy działania terpenów, takie jak formacja colloidu[39] nadal muszą zostać wykluczone.
Nasze badania sugerują poli-farmakologię terpenów, z wieloma docelowymi receptorami, włączając w to CB1/2 i A2a. Inni autorzy, którzy badali niektóre z tych terpenów w kontekście olejków eterycznych, wykryli glutaminianergiczne[40], serotoninergiczne[41] lub dopaminergiczne[42] oddziaływania. Koaktywacja takich systemów GPCR lub kanałów jonowych z receptorami CB1 i/lub CB2 mogłaby wyjaśniać dlaczego obserwowaliśmy różnice między terpenami w interakcji z kannabinoidami i wpływie CB1 i A2a na różne zachowania tetrody. Wydaje się więc, że zaobserwowane efekty wywołane przez terpeny są złożonym rezultatem aktywacji lub inhibicji wielu systemów receptorowych.
Ta złożona poli-farmakologia może dostarczyć unikatowych możliwości wykorzystania terpenów w celu wzmocnienia terapii kannabinoidami i innych terapii. W naszych badaniach wykazaliśmy, że wszystkie terpeny synergizują z WIN55,212-2, wzmacniając anty-nocycepcję (Fig. 2), i interagując różnie z WIN55,212-2 w przypadku innych zachowań (Fig. 3-5). Sugeruje to, że terpeny mogą zostać wykorzystane w celu wzmocnienia właściwości przeciwbólowych terapii konopiami/kannabinoidami, bez zwiększania efektów ubocznych związanych z terapią kannabinoidami. Jednakże musi to zostać potwierdzone z wykorzystaniem odpowiednich fitokannabinoidów, takich jak THC, zamiast syntetycznego kannabinoidu WIN55,212-2, który został wykorzystany w naszym badaniu. Identyfikacja specyficznych kombinacji terpen:kannabinoid z maksymalnym indeksem terapeutycznym dla konkretnego stanu chorobowego mogłaby otworzyć nowe możliwości terapii z zastosowaniem tych środków.